牙鲆(Paralichthys olivaceus) Activin 基因两种β亚基的启动子克隆及生物信息学分析

以牙鲆为研究对象,利用染色体步移(Genome walking)获得了 Activin 两个β亚基基因的上游部分启动子序列,并对其进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。获得了 Activin βA 和βB两个亚基的启动子部分序列,长度分别约为2.7 kb 和2.4 kb;在预测的 Activin βB 转录起始位点(+1位)的上游31 bp 处有1个典型的 TATA box,而在 Activin βA 中未发现 TATA box 的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子 Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF 等结合位点,还发现了与内分泌相关的 Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR 等结合位点,但肌性转录因子 MyoD、myogenin 和雄性的性别决定基因 SRY 结合位点仅在 Activin βA 启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆 Activin βA 和βB 表达受到多种潜在因子的调控,二者在调控上有所差异。     

牙鲆JNK2基因的表达分析及免疫功能探究

本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库，得到牙鲆JNK2基因(PoJNK2)并利用PCR技术进行序列验证。PoJNK2的开放阅读框长度为1263 bp，编码420个氨基酸；通过SMART服务器对PoJNK2的结构域进行预测，显示PoJNK2具有典型的丝氨酸?苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc。利用qRT-PCR分析PoJNK2在牙鲆成体不同组织中的表达水平，发现其在牙鲆免疫组织中均有表达，因此，初步推测PoJNK2在牙鲆免疫应答方面可能发挥作用。本研究设计了体内迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)侵染实验和体外免疫刺激细胞实验以探究PoJNK2在牙鲆免疫反应中的作用。在迟缓爱德华氏菌体内注射牙鲆成体后，PoJNK2在脾脏、头肾和鳃中有不同程度的表达上调。同时，使用迟缓爱德华氏菌、Poly I:C和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)刺激牙鲆鳃细胞系后，发现PoJNK2在不同时间点表达上调。除此之外，通过细胞转染实验在牙鲆鳃细胞系中过表达PoJNK2，发现其对下游炎症细胞因子的表达及激活蛋白Activator protein-1 (AP-1)的转录活性具有显著的上调作用，进一步阐明了PoJNK2在调节牙鲆免疫应答方面的作用。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus) Activin基因两种β亚基的启动子克隆及生物信息学分析

以牙鲆为研究对象,利用染色体步移(Genome walking)获得了Activin两个β亚基基因的上游部分启动子序列,并对其进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。获得了Activin βA和βB两个亚基的启动子部分序列,长度分别约为2.7 kb和2.4 kb;在预测的Activin βB转录起始位点(+1位)的上游31 bp处有1个典型的TATA box,而在Activin βA中未发现TATA box的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF等结合位点,还发现了与内分泌相关的Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR等结合位点,但肌性转录因子MyoD、myogenin和雄性的性别决定基因SRY结合位点仅在Activin βA启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆Activin βA和βB表达受到多种潜在因子的调控,二者在调控上有所差异。     

海湾扇贝南部亚种遗传多样性和选择特征的基因组学解析

为了探究海湾扇贝南部亚种(Argopecten irradians concentricus)的遗传多样性特征,通过全基因组重测序分析,系统解析了其群体遗传结构以及其与海湾扇贝北部亚种(Argopecten irradians irradians)间的遗传差异,共筛查出15059961个高质量单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点。基于全基因组SNP的群体祖先成分推断、主成分分析和系统发生重构皆表明,南北亚种之间存在较为显著的遗传分化。其中,海湾扇贝南部亚种的近交水平和连锁不平衡程度更高。通过选择性清除分析,在海湾扇贝南部亚种中共鉴定出349个正选择基因,其中GHSR、HSF1、HABP2和Dna J等基因可能与其生长速度较快、耐热性较强以及免疫功能较强等环境适应性特征相关。该研究揭示了海湾扇贝亚种间遗传分化和选择特征,为扇贝的基因组研究和分子育种提供了数据支持。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)丝氨酸蛋白酶Ⅰ-1基因多态性

采用重测序方法,利用牙鲆(Paralichthys olivaceus)野生个体,扩增了牙鲆丝氨酸蛋白酶(Serine protease) I-1基因的编码区(CDS)和2605 bp的启动子序列。在牙鲆丝氨酸蛋白酶I-1基因(PoSP I-1)编码区中筛选出9个单核苷酸多态性位点(SNPs),同时在其启动子区筛选出28个SNP位点。对感染鳗弧菌的抗病牙鲆和易感牙鲆进行了部分SNP位点的分型,通过分析CDS中SNP位点的分布情况,发现SNP365A/G位点在抗病个体中的AG基因型的基因频率是60%,高于易感个体的40% (P=0.01)。qRT-PCR结果显示,易感个体在细菌感染后,PoSP I-1相对表达量相比对照组呈下降趋势。在抗病个体中,PoSP I-1相对表达量相比对照组呈上升趋势,且高于易感个体。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因在牙鲆抗鳗弧菌感染中发挥重要作用,该基因的SNP365A/G位点是与牙鲆鳗弧菌感染相关的候选位点,该位点可作为牙鲆抗鳗弧菌选择育种的潜在标记。     

牙鲆头肾巨噬细胞的分离培养与鉴定

本研究使用密度梯度离心法从牙鲆(Paralichthys olivaceus)头肾中分离得到了巨噬细胞,通过差速贴壁法对获得的细胞进行纯化,后续经过优化培养条件和培养过程,采用L-15培养基(Gibco)、5%胎牛血清、1%青–链霉素、1%非必需氨基酸、30% L929细胞培养基在24℃、无CO2的条件下进行培养。显微镜观察及吉姆萨染色结果显示,贴壁细胞具备巨噬细胞形态特征,使用巨噬细胞特异性基因标记mpeg1基因对细胞进行鉴定,在分离得到的细胞中成功扩增出该基因。本研究为体外研究巨噬细胞功能、深入了解硬骨鱼先天性免疫奠定了基础。     

半滑舌鳎生长因子midkine的定点改造及原核表达

为进一步研究半滑舌鳎midkine(MK)成熟肽活性与功能,对半滑舌鳎生长因子MK成熟肽进行定点改造及原核表达.根据大肠杆菌偏爱密码子的特点,实验利用SOEing PCR法对半滑舌鳎MK成熟肽进行定点突变.将改造后的半滑舌鳎成熟肽MK克隆到载体质粒pET32a(+),构建原核表达载体pET32a(+)-MK,并转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株中.SDS-PAGE结果显示,与对照组相比,经IPTG诱导表达后半滑舌鳎重组蛋白MK存在于大肠杆菌上清液中,产物相对分子质量约为33 ku.研究表明,本实验对半滑舌鳎生长因子midkine成功进行了定点改造,原核表达质粒成功构建并在大肠杆菌中高效表达,且主要以可溶形式存在.     

鱼类脂味觉的行为学检测

选取斑马鱼和蓝鲨为代表,设计并改进了一系列味觉行为学实验方法来探索鱼类的味觉感受.结果表明,斑马鱼和蓝鲨除了具有对苦味和鲜味的感受外,很可能具有对脂肪酸的味觉感受.研究发现,蓝鲨对甜味具有偏好性,这与斑马鱼无甜味感受能力的报道不同.     

干露胁迫对鼠尾藻生理生化影响的研究

鼠尾藻(Sargassum thunbergii)集生于中潮带和低潮带岩石上，在高、中潮带的水陆或石沼中，有的甚至在低潮时较长时间暴露于日光下。低潮露空下的干露胁迫是影响鼠尾藻生存的关键因子。本研究采集野生鼠尾藻为实验材料，在培养箱中分别失水干露0、1、3、6 h，并在海水中恢复培养，测定不同胁迫时间下藻体的失水率、叶绿素荧光参数和生化参数。结果显示，不同大小的鼠尾藻干露胁迫不同时间后的失水率显著不同，胁迫时间越短，藻体越大，失水率越低，大藻体鼠尾藻的保水能力高于小藻体；干露胁迫使鼠尾藻的叶绿素荧光值显著降低，同株鼠尾藻不同部位对干露胁迫的耐受程度显著不同，梢部耐受能力较差，基部耐受能力较强，小藻体和大藻体的梢部伤害较大，不能恢复，鼠尾藻基部可恢复正常生理状态，干露胁迫时，鼠尾藻以非调节性能量耗散机制为主；干露胁迫时，藻体梢部通过抗氧化酶类[(抗超氧阴离子自由基(ASAFR)、超氧化物歧化酶(SOD))和非抗氧化物质(可溶性糖、脯氨酸)共同作用来应对胁迫，藻体基部主要是通过上调蛋白、可溶性糖和脯氨酸等含量抵抗胁迫。高中潮带的鼠尾藻较易处于高温、强光和干露失水叠加的胁迫状态，同时，又因外部形态和生活环境的不同，藻体各部分的生理生化特性也有一定的差异。本研究探讨了鼠尾藻干露胁迫下的生理生化状态，对研究鼠尾藻抵抗环境胁迫的生态适应性具有重要的指导意义。     

海带孢子囊发育过程中的形态结构与生理生化变化研究

本研究以海带(Saccharina japonica)杂交品系“玉带1号”为研究对象，根据孢子囊形成过程中的外观形态，将孢子囊形成与发育过程分为5个阶段，系统观察了孢子囊形成过程中的外观形态和组织结构变化，研究了孢子囊发育不同阶段生理生化特征的变化规律。结果显示，在孢子囊发育过程中，孢子体表面依次出现光滑、磨砂、突起、破皮和光滑等表观现象，伴随着表皮细胞的突起、隔丝的伸长、孢子母细胞的分化与发育，以及游孢子的形成和释放等组织变化过程；另外，在孢子囊发育过程中，海带孢子体对氮的积累持续增加，蛋白含量呈先显著增加到释放游孢子阶段又有所降低的趋势；过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子含量的变化趋势相似，在孢子囊形成初期，其含量呈先上升到后期又有所下降；不同抗氧化酶在孢子囊形成过程中的活性变化存在差异，其中，超氧化物歧化酶(MDA)活性总体呈下降趋势，而抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性均呈先上升后下降的趋势，丙二醛(MDA)含量无显著变化；在孢子囊发育过程中，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性呈先降低后升高的趋势，苹果酸脱氢酶(MDH)活性无显著变化。本研究有助于加深对海带杂交品种孢子囊形成过程及生理生化特征的理解，可为海带杂交品种孢子囊的人工诱导提供理论依据。